PCR實驗室基礎知識

　　為了對以個特定序列進行PCR做重複檢測,需要三個（gè）不同的區域,每一個（gè）區域的具體技術操作和試劑在下麵詳細列出

　　1、樣品準備區（qū）

　　這個區域專門用作樣品的準備，在製備和操作用於核酸提取的試劑時應該采

　　取預防措施：

　　1)PCR產物和帶（dài）有要擴增序列（liè）的DNA克隆不能在這個房（fáng）間操（cāo）作。

　　2)組織培養（yǎng）物、組織標本和血清樣品都（dōu）帶進（jìn）樣品準備間處理，以根據應用的需要提取DNA或RNA。

　　3)用於樣品處理的工具不能被用（yòng）作普通分子克隆的工具，也不能用作操（cāo）作（zuò）靶（bǎ）序（xù）列。

　　4)DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止（zhǐ）在吸取樣品時有氣溶膠遺留。

　　5)大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。

　　6)管子打開前都要簡（jiǎn）短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠。

　　7)任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手（shǒu）套要經常更換，尤其在抽提過程中（zhōng）每一（yī）步之間（jiān）都要更換。實驗服要專門（mén）用於樣品準備間，經（jīng）常清（qīng）洗。

　　2、樣品準備和（hé）RNA-PCR

　　RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣（yàng）增加了樣品之間汙染（rǎn）的機會。

　　3、前PCR區

　　必須有專門用於準備各種反應的區（qū）域，這個（gè）區域（yù）必須保持幹淨，而且沒有來（lái）自克隆（lóng）和樣（yàng）品準備的汙（wū）染。前PCR區必須要有試劑和準備（bèi），特別是專門用於前PCR區的正壓活塞式移液管。

　　4、PCR實驗室試劑的操作

　　1)所用的所（suǒ）有溶液都應該沒有核酸和(或)核酸（suān）酶（méi）(DNase和（hé）RNase)汙染。

　　2)所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的-新鮮蒸餾的（de）去離子（zǐ）水，用0.22μm過濾的，並且是高壓滅菌。

　　3)在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或（huò）樣品製備試劑中加入0.025%的（de）疊氮鈉不抑製擴（kuò）增反應。

　　4)所（suǒ）用（yòng）試劑（jì）都應該以大體（tǐ）積配製，實驗一下看試劑是否滿意，然後（hòu）分裝成僅夠（gòu）一（yī）次使用的量進行貯存。

　　5)所（suǒ）有試劑和樣品（pǐn）準備過程中都要使用一次（cì）性滅菌的瓶子和（hé）管子。

　　6)新配製的試劑在用（yòng）於準備新的標本之前應該加以（yǐ）檢驗。

　　7)樣品準（zhǔn）備（bèi）和前PCR區所使用的移液管在不使用時都應該（gāi）小心保存。

　　5、在前PCR區建立PCR混合物

　　1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好（hǎo）、分裝（zhuāng）並保（bǎo）存在-20℃或4℃，在實驗室隻涉及到擴增（zēng）一種或少數幾（jǐ）種特異序列時這樣做很有用。

　　2)如（rú）果你的實驗（yàn）室使用多套引物，以致於（yú）配製包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。

　　3)作為一個規則，應該（gāi）保存一套陰性（xìng）、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配（pèi）製（zhì）和PCR前過程的效率和潔淨程度。而且，你也（yě）希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證（zhèng）你的樣品緩衝液以證明裏麵不（bú）含擴增抑製物。